Minicircle DNA是去除了细菌骨架序列（原核复制起始位点、抗性基因等）的微型共价闭合环状DNA，仅保留目的基因表达盒。与传统质粒相比，可显著降低免疫原性，提高体内转基因表达效率和持续时间，是非病毒基因治疗和细胞重编程的重要工具。
环状无骨架 DNA 的概念早于 CRISPR：环状小载体在大小与未甲基化 CpG 负荷上较传统质粒更利于某些体内表达。Kay 等利用位点专一重组在细菌内将亲本质粒拆分为 minicircle 与带骨架的 miniplasmid，再通过酶切与层析分离开环状与副产物。该路线被后续基因治疗、干细胞重编程等研究在工艺细节与内毒素控制上持续引用。
与细菌骨架相关的免疫学考量
细菌来源序列富含可被 PRR 识别的基序，去除骨架可降低部分非特异性炎症反应，具体体内表现仍与给药途径、剂量与递送系统绑定。
相比传统质粒，Minicircle DNA在多个关键指标上具有显著优势。
去除原核CpG序列（细菌骨架中CpG富集区域是激活先天免疫的主要原因），显著降低体内免疫激活，减少炎症反应对转基因表达的抑制。
体积更小（约为传统质粒的30–50%），在相同质量下含有更多功能性分子数，细胞摄取效率和核转运效率均优于传统质粒。
Kay等（2010）研究显示，Minicircle在小鼠肝脏中的表达持续时间比传统质粒长14倍以上，在iPSC重编程中也显示出更稳定的转基因表达。
不含抗生素抗性基因，消除了基因治疗产品中抗性基因水平转移的潜在生物安全风险，更符合监管要求。
Minicircle通过ParA位点特异性重组酶系统在大肠杆菌中完成重组与纯化。
将目的表达盒克隆至含attB/attP重组位点的亲本质粒
阿拉伯糖诱导ParA重组酶，attB×attP重组产生Minicircle和miniplasmid
I-SceI内切酶消化miniplasmid，碱裂解法分离Minicircle
阴离子交换层析（Endofree级）去除内毒素
超螺旋比例、内毒素、浓度、无菌检测
| 特性 | Minicircle DNA | 传统质粒 |
|---|---|---|
| 大小 | 仅含表达盒（~2–6 kb） | 表达盒+细菌骨架（通常5–12 kb） |
| CpG含量 | 极低（去除细菌骨架） | 高（含原核复制子和抗性基因） |
| 免疫激活 | 弱 | 较强（TLR9途径） |
| 体内表达持续时间 | 长（可数周至数月） | 短（通常数天） |
| 抗性基因 | 无 | 含（氨苄/卡那等） |
| 生产复杂度 | 较高（需重组酶步骤） | 标准（碱裂解法） |
| 适用场景 | 基因治疗、细胞重编程、睡美人转座 | 通用研究工具 |
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